Validação de células editadas por CRISPR através de detecção de imagem e Western Blot em uma leitora de microplaca.

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ID Artigo HE234

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Data da Publicação 10/27/2020
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Pergunta ou Título
Validação de células editadas por CRISPR através de detecção de imagem e Western Blot em uma leitora de microplaca.
Resposta
A edição do genoma tem sido amplamente usada para estudar a expressão do gene e a função da proteína, mas muitos desses métodos são trabalhosos e imprecisos. O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 se tornou uma ferramenta muito popular para edição de genes devido à sua alta precisão e facilidade de uso. O sistema CRISPR  se originou como parte do sistema imunológico inato de bactérias e arquéias e era usado para proteger contra DNA estranho. Sequências curtas de DNA estranho conhecido são expressas como RNA de direcionamento CRISPR (crRNA), que orienta a enzima Cas9 a clivar qualquer DNA estranho contendo uma sequência semelhante. Aproveitando esse sistema, os pesquisadores podem estudar os efeitos do silenciamento de genes e da regulação da transcrição, e podem potencialmente aliviar distúrbios genéticos em células doentes.

Um RNA guia (gRNA) semelhante a um crRNA é construído para atingir uma região no gene, e a enzima Cas9 pode criar quebras de cadeia dupla nesta região específica do genoma da célula hospedeira. Depois que uma quebra da fita dupla é feita, a célula passará por uma das duas vias de reparo: a via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou a via de recombinação dirigida por homologia (HDR). A via NHEJ é comumente usada para interromper genes por meio de inserções ou deleções de base (indels), enquanto a via HDR pode ser usada para interromper um gene repórter ou uma sequência editada trocando sequências entre duas moléculas de DNA semelhantes ou idênticas.

A validação da edição do gene é necessária para determinar se a mutação introduzida knocked down o gene de interesse. Normalmente, os testes de PCR genômico e de sequenciamento genético são realizados para confirmar exclusões ou inserções bem-sucedidas, no entanto, medir a expressão da proteína é uma medida mais definitiva de knockdown do gene.

A nota de aplicação demonstra como a leitora de microplaca Multi-Mode SpectraMax i3x e o sistema de detecção de Western Blot ScanLater podem ser usados para validar a edição do genoma CRISPR / Cas9. Foi interrompida a expressão da proteína 5 Autophagy Related (ATG5) em células HEK293 por knockdown do gene humano ATG5 via kit CRISPR e knock-in de proteína fluorescente verde (GFP) e genes de resistência à puromicina. Knockdown foi verificado com análise de Western blot ScanLater e a eficiência da transfecção foi avaliada identificando células GFP-positivas versus células não-transfectadas.

https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/br/validate-crispr-edited-cells-using-imaging-and-western-blot-detection-on-a-microplate-reader